张绪慧 陈达理 董小锋（南方医科大学 广州510515） 第一部分：纯中药复方消癌根对肿瘤生长的影响 材料与方法 一、 实验动物 昆明种小鼠60只，4-6周龄，体重18-22g，雄性，购自南方医科大学动物中心。试验前分笼饲养适应环境1周，试验过程中动物自由摄食、饮水、鼠房保持通风，室温保持在25±2℃，光照周期12/12小时。 二、 细胞株 细胞株为小鼠腹水型肝癌细胞株S180细胞，皮下接种可生成肉瘤。购于中山医科大学肿瘤研究所，常规复苏传代培养。 三、 主要药物、试剂和仪器 纯中药复方消癌根，由董草原医生提供。 环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号02071121。 四、 消癌根药液的制备 消癌根是由纯中药粉碎而得的黑褐色药粉。根据人与小鼠药物剂量换算公式：d小鼠=d人×(k小鼠、/k人)，k小鼠、k人分别为小鼠和人的折算系数）算出小鼠每日给药剂量。取体重为50kg正常成人每日口服消癌根剂量为9g，算得小鼠每日给药低剂量，再将其剂量增加一倍设为高剂量；然后算出药液所要浓度。用蒸馏水将消癌根分别配成每毫升含0.10g、0.05g生药的高、低两个剂量组的悬浊液，4℃冰箱保存，用时摇匀。 用无菌生理盐水将环磷酰胺稀释成为2mg/ml, 4℃冰箱保存。 五、 荷瘤小鼠模型的建立 体外复苏培养S180细胞：将S180细胞培养于含体积分数为10%小牛血精的RPMI-1640营养液（含青霉素100×103U/L和链霉素100mg/L）中，置于37℃、含5%CO2的培养箱内。该细胞呈贴壁生长，取指数生长期的细胞，用0.5%胰蛋白酶消化，机械吹打成细胞悬液，PBS洗涤2次，2000r/min离心5min，弃上清液，用无菌生理盐水稀释，调整到2-3×106/ml个瘤细胞，随机先取5只健康昆明种小鼠，每只用上述细胞悬液0.4ml腹腔注射，注意观察接种小鼠腹水生长情况，约一周后接种小鼠腹部显显涨大、凸出。将其颈椎脱白处死，固定于蜡板上，无菌抽取乳白色腹水液，以0.9%氯化钠溶液1:1稀释，经0.2%台盼兰染色后计算活细胞数＞95%，调整瘤细胞悬液浓度为6×106/ml个瘤细胞，每只小鼠右后肢臂部皮下接种0.2ml。共接种44只小鼠。24小时后用药。 六、 实验分组和给药 将44只造模成功的小鼠随机分为4组，每组11只，组内编号。4组分别为：消癌根高剂量组、消癌根低剂量组、阴性对照组及环磷酰胺组。所有处理自造模第二天开始：消癌根高、低剂量组分别按24g•kg-1•d-1•2g•kg-1•d-腹腔注射。连续用药15天后停药，处死小鼠，剥离瘤块，用滤纸吸干后，称取瘤重。 七、 评定指标 （1） 肿瘤抑制百分率（抑瘤率）： 抑瘤率（%）=阴性对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重×100% 阴性对照组平均瘤重 （2）给药期间，每隔三天用游标卡尺由体外测出瘤体的长径和短径，然后根据体积=长径×短径2，绘出肿瘤生长图。 八、 统计学处理 实验结果用均数±标准差（X±s）表示，实验资料采用SPSS10.0统计软件包处理。 结果 一、 瘤重和抑瘤率 消癌根对S180移植性肿瘤的抑制作用。如表1所示，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组与阴性对照组比较，其瘤重均显著减轻（P＜0.05＝；消癌根高剂量组的瘤重与消癌根低剂量比较亦明显减轻（P＜0.05＝;消癌根高剂量组与环磷酰胺组比较其瘤重有显著性差异（P＜0.05＝）;环磷酰胺组抑瘤率最高。 表1 消癌根对S180移植性肿瘤的抑制作用（x±s） 组别 n 瘤重 抑瘤率 始 末 (g) （%） 阴性对照组 11 11 8.01±1.15 — 环磷酰胺组 11 11 4.36±0.75* 45.6 消癌根高剂量组 11 11 5.19±0.73*▲△ 35.2 消癌根低剂量组 11 11 6.24±1.15* 22.1 注：与阴性对照组比较：*P＜0.05 与消癌根低剂量组比较：▲P＜0.05 与环磷酰胺组比较：△P＜0.05 二、 肿瘤的生成曲线 以时间为横轴，肿瘤体积为纵轴绘制肿瘤的生长曲线。 图1 瘤块生长曲线 讨论 一、 小鼠腹水型肝癌细胞株S180细胞的选择 国内研究者对S180生物学特性、免疫学、细胞系的建立及移植实验条件等方面做了较为深入的研究。由于其造模时间短、接种成功率高的特点，均一性好，目前此模型已广泛地用于肿瘤基础研究及药物筛选，成为研究中医药抗肿瘤的作用及机制的一个公认的肿瘤模型。 本实验采用购自中山医科大学肿瘤研究所的S180细胞，进行小鼠皮下肿瘤造模。经过对S180细胞复苏，传代，右后肢臂部皮下接种，成功地造出44只荷瘤小鼠，造模成功率达100%。这一模型具有明显外部特征，容易观察、测量皮下瘤块的生长情况，以后映出各实验组的药效。另外，本实验中的荷瘤小鼠皮下肿瘤易剥离，以便较为精确地称重、计算抑瘤率。 二、 消癌根对肿瘤的抑制作用 消癌根是董草原医生历经30多年研究探索、临床应用总结出来的纯中药方剂。大量临床实践证明该方治疗肿瘤有效，但尚未做有关消癌根实验研究、机理探讨方面的试验。本实验拟考察消癌根的抗肿瘤效果，以S180荷瘤小鼠为实验对象，将环磷酰胺设为阳性对照药，生理盐水组作为阴性对照组进行操作。环磷酰胺是临床常用的化疗药，其能有效地杀伤癌细胞（本实验其抑瘤率达到45.6%）。药效方面，消癌根高剂量组抑瘤率达到35.2%，消癌根低剂量组亦达到22.1%，消癌根高剂量组平均瘤重与低剂量组平均瘤重存在显著性差异〔P＜0.05＝〕。这说明消癌根在抗肿瘤方面有一定疗效，并且存在着一定的量效趋势。 消癌根的抗肿癌机理可能是通过抑制捐资血管生成来实现的。将在以下部分实验中予以探讨。 第二部分：纯中药夏方消癌根对肿瘤血管的影响 材料与方法 一、 实验动物 昆明种小鼠60只，4-6周龄，体重18-22g，雄性，购于南方医科大学动物中心。分笼饲养，自由摄食、饮水，鼠房保持通风。 二、 细胞株 细胞株为小鼠腹水型肝癌细胞株A180细胞，皮下接种可生成肉瘤。购于中山医科大学肿瘤研究所，常规复苏传代培养。 三、 主要药物、试剂和仪器 纯中药复方消癌根，由董草原医生提供。 环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号02071121。 PCNA一抗 武汉博士德生物工程有限公司产品 VEGP一抗 武汉博士德生物工程有限公司产品 生物素化兔抗山羊二抗试剂盒 武汉博士德物工程有限公司产品 试剂盒中内容： H2O2浓缩液 4ml 封闭液Ⅰ 既用型 4ml 封闭液Ⅱ 既用型 4ml 生物素化兔抗山羊IgG 既用型 4ml 抗原冷修复液 既用型 4ml DAB显色剂试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司产品试剂盒中内容： 显色剂A DAB×20 3ml 显色剂B H2O2×20 3ml 显色剂C TBS×20 3ml 四、 主要溶液的配制： 0.01MPBS缓冲液（PH7.2-7.4）:1000双蒸水中，加氯化钠9g,NaH2PO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H20 0.4g,调整PH值至7.2-7.4 0．1M枸椽酸缓冲液（PH6.0）：1000ml双蒸水中加枸椽酸三钠（C6H5Na3O7•2H2）3g，枸椽酸（C6H8O7•H2O）0.4g。调PH至6.0。 3%H2O2甲醇或0.01MPBS,97ml加入3ml市售的30%H2O2既得3%H2O2。 五、 消癌根药液的制备（同第一部分） 六、 荷瘤小鼠模型的建立（同第一部分） 七、 实验分组和给药（同第一部分） 连续用药15天后停药，处死小鼠后剥离瘤块，10%甲醛固定。 八、 取材的处理（固定、脱水、浸蜡、包蜡、切片） 组织块在甲醛里固定6个小时后取出用流水冲洗，滤纸吸去多余水分。注意遵守以下原则：（1）取材时避开瘤体中央液化坏死区，避免在瘤体外周取材，取材部位应介于两者之间。（2）从剥离瘤体、切取组织块到投入固定液，要尽量迅速，以尽量保持材料的新鲜，一般在1分钟内把组织块浸入固定液。（3）所用的固定液及容器必须预冷，以降低离体细胞内水解酶的活性，尽可能减少细胞自溶。（4）切割组织的刀必须锋利干净，操作时必须避免拉、锯、压等动作以免造成细胞损伤。 1． 脱水和包埋： 70%乙醇 4℃ 1h 80%醇 4℃ 1h 90%乙醇 4℃ 1h 95%乙醇 4℃ 1h 100%乙醇Ⅰ 4℃ 30min 100%乙醇Ⅱ 4℃ 30min 100%乙醇Ⅲ 4℃ 30min 二甲苯Ⅰ 4℃ 30min 二甲苯Ⅱ 4℃ 30min 二甲苯Ⅲ 4℃ 30min 石蜡Ⅰ 4℃ 30min 石蜡Ⅱ 4℃ 30min 石蜡Ⅲ 4℃ 30min 石蜡Ⅳ 4℃ 30min 包蜡 ＜60℃ 2． 切片前载玻片涂粘附剂：将待涂载玻片放在玻片架上浸入粘片剂APES与丙酮混合液（比例：1：50）中，常温下晾干备用。 3． 切片：厚度一般在4-6μm。 烤片：切片附粘后置60℃ 保存：备用切片置4℃冰箱中保存。 九、 免疫组化染色 1． 石蜡切片常规脱蜡至水 二甲苯Ⅰ 50min 二甲苯Ⅱ 50min 二甲苯Ⅲ 50min 无水乙醇Ⅰ 1min 无水乙醇Ⅱ 1min 95%酒精 30s 90%酒精 30s 80%酒精 30s 2.30%H2O2加蒸馏水10份混合，室温10min(10min-1h)以灭活内源性过氧化物酶活性，蒸馏水洗2min×3次 3．热修复抗原：将切片放入盛有枸椽酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃-98℃之间并持续10-15分钟。取出容器，室温冷却10-21min,蒸馏水冲洗2次，PBS洗2×3min。 4． 抗原修复液Ⅰ：滴加在切片上室温5-10 min后，PBS洗2×3min。 5． 滴加正常山羊血清封闭液，室温30min，甩去多余液体，不洗。 6． 滴加PCNA/VEGF一抗，37℃孵育1h左右，或4℃过夜，PBS洗，3×5min。 7． 滴加生物素化二抗，37℃20 min，PBS洗，3×5min。 8． 滴加试剂SABC，37℃20 min，PBS洗，4×5min。 9． DAB显色：取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至切片。室温显色，控制反应时间，一般5-30min（视显色的具体情况而定），蒸馏水洗涤。3×5min。 10．苏木素轻度复染，约60s。 11．中性树胶封片。设阴性对照切片，用PBS代替特异性第一抗体。 十、 HE染色 染色方法： 二甲苯Ⅱ 50min 二甲苯Ⅲ 50min 无水乙醇Ⅰ 1min 无水乙醇Ⅱ 1min 95%酒精 30s 90%酒精 30s 80%酒精 30s 苏木清 10min(蒸馏水洗数秒) 1%盐酸酒精分化 20s 流水冲洗（返蓝） 5min 伊红 1min30s 90%酒精 30s 95%酒精 30s 无水乙醇Ⅰ 5min 无水乙醇Ⅱ 5min 无水乙醇Ⅲ 5min 二甲苯石炭酸 5min 二甲苯Ⅰ 5min 二甲苯Ⅱ 5min 十一、结果判断 1． 肿瘤内微血管计数（microvesseldensitycount,MDC）:于每只荷瘤小鼠瘤体内的5个不同部位取材，每块5mm×5mm×2mm,排除肿瘤出血区及边缘反应区。应用HE染色，低倍镜（×40）观察确定每例切片中3个血管计数最高区域，然后在高倍镜（×100）下记数热点区域（hotspots）内每高倍镜视野的MDC，为了避免较大血管对计数的干扰，对管壁有较厚平滑肌包绕或管腔＞8个细胞面积的血管不予计数。其平均值即为该例肿瘤的MDC值。 2． PCNA的阳性判断标准，细胞核染成棕黄色或棕褐色为阳性反应，每个标本随机观察10个高倍镜视野（×100），计算每个高倍镜视野100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均值作为PCNA的阳性细胞数。VEGF以细胞浆内出现棕黄色为阳性，算阳性区域面积占瘤细胞总面积的百分率表示。 结果 一、 消癌根对肿瘤组织微血管计数（MDC）的影响 如表2所示：与阴性组相比较，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组的MDC均明显降低（P＜0.05＝）。而环磷酰胺组的MDC与阴性对照组比较无显著性差异（P＜0.05）。消癌根高剂量的MDC明显低于消癌根低剂量组的MDC（P＜0.05）。 表2 消癌根对肿瘤组织微血管密度（MDC）的影响（x±s） 组别 n 剂量 MDC 始 末 (g/kg) （条） 阴性对照组 11 11 — 15.7±1.4 环磷酰胺组 11 11 20 14.8±1.7 消癌根高剂量组 11 11 24 5.6±1.7*▲ 消癌根低剂量组 11 11 12 8.2±4.6* 注：与阴性对照组比较：*P＜0.05 与消癌根低剂量组比较：▲P＜0.05 二、 消癌根对肿瘤组织血管内皮生长因子（VEGF）的影响 对于VEGF的表达，消癌根剂量组织和消癌根低剂量组均显著弱于阴性对照组（P＜0.05）。消癌根高剂量组和消癌根低剂量组VEGF的表达明显减弱，与环磷酰胺组相比较有显著性差异（P＜0.05）。消癌根高剂量组与消癌根低剂剂量组比较，其VEGF的表达亦明显减弱（P＜0.05＝。（如表3所示） 表3 消癌根对肿瘤组织血管内皮生长因子（VEGF）的影响（x±s） 组别 n 剂量 MDC 始 末 (g/kg) （条） 阴性对照组 11 11 — 13.50±1.60 环磷酰胺组 11 11 20 9.08±3.50 消癌根高剂量组 11 11 24 4.49±2.18*▲ 消癌根低剂量组 11 11 12 7.51±1.68*△ 注：注：与阴性对照组比较：*P＜0.05 与消癌根低剂量组比较：▲P＜0.05 与环磷酰胺组比较：△P＜0.05 三、 消癌根对肿瘤组织增殖细胞核抗原（PCNA）的影响 如表4所示，对于PCNA的表达，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组与阴性对照组比较均显著减弱（P＜0.01＝）。与环磷酰胺组相比较，消癌根高剂量组和消癌根低剂量组PCNA的表达均明显减弱（P＜0.01＝）。消癌根高剂量组的PCNA的表达明显弱于消癌根低剂量组（P＜0.01＝）。 表4 消癌根对肿瘤组织细胞增殖核抗原（PCNA）的影响（x±s） 组别 n 剂量 MDC 始 末 (g/kg) （条） 阴性对照组 11 11 — 54.73±2.58 环磷酰胺组 11 11 20 34.01±2.52 消癌根高剂量组 11 11 24 12.10±1.86*▲ 消癌根低剂量组 11 11 12 22.84±2.26*△ 注：注：与阴性对照组比较：*P＜0.05 与消癌根低剂量组比较：△P＜0.05 与环磷酰胺组比较：▲P＜0.05 讨论 由于肿瘤血管生成在肿瘤生成及肿瘤侵袭转移中的重要作用，以及VEGF对肿瘤血管形成的促进作用已在多种肿瘤中得以证实，VEGF可作为抗癌治疗的新靶点，针对VEGF及其受体的抗血管治疗，为肿瘤防治开辟了另一新途径。 本实验以S180荷瘤小鼠为研究对象，分别以环膦酰胺和蒸馏水为阳性对照和阴性对照，来研究消癌根的抑瘤情况及其可能的机理。结果表明消癌根高剂量组抑瘤率达到35.2%,低剂量组亦达到22.1%。说明该药具有一定的抗肿瘤效果。其机理可能是通过抑制VEGF、PCNA的表达来实现的。 |
